熒光分光光度計是屬于分光光度計的一種，在生物化學、生物醫學、環境化工等部門的應用較為廣泛，熒光分光光度計是對經光源激發后產生熒光的物質或經化學處理后產生熒光的物質成份分析的儀器物質熒光的產生是由在通常狀況下處于基態的物質分子吸收激發光后變為激發態, 這些處于激發態的分子是不穩定的，在返回基態的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產生熒光．不同物質由于分子結構的不同,其激發態能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現為各種物質都有其特征熒光激發和發射光譜。熒光分光光度計的工作原理就是根據這一現象設計的，是由高壓汞燈或氙燈發出的紫外光和藍紫光經濾光片照射到樣品池中，激發樣品中的熒光物質發出熒光，熒光經過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數字的形式顯示出來。

二、熒光分光光度計構成

隨著科技的進步帶動著生產工藝技術的提升熒光分光光度計的從手控式熒光分光光度計發展到自動記錄式熒光分光光度計以及現在的計算機控制式熒光分光光度計都是有以下幾部分組成。

1、光源

一般是為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發射出強度較大的連續光譜，且在300nm～400nm 范圍內強度幾乎相等，所以更為常用。

2、激發單色器

作為篩選特定的激發光譜器是置于光源和樣品室之間，也稱喂單色器。

3、發射單色器

作為篩選特定的發射光譜器也成為第二單色器，是至于置于樣品室和檢測器之間。常采用光柵為單色器

4、樣品室

用于盛放樣品的空間，通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。樣品不同時光源與檢測器的角度有所不同，測量固體樣品是直角，測量液體樣品時銳角。

5、檢測器

作為光信號放大的同時還是將光信號轉化為電信號。一般是用光電管或光電倍增管作檢測器。

三、熒光分光光度計使用方法

（一）實驗前準備工作

1、實驗所需樣品若是液體時，要檢查濃度范圍是否合適，是否需要稀釋，以及所需要的溶劑類型以及稀釋倍數。

2、實驗所需樣品若是固體時，要產看是否為均勻粉末、片狀、是否可直接測定等。

3、檢查電源電壓是否符合設備要求，以及接地設施是否連接。

4、查看環境是否符合設備工作所需環境要求，環境溫度應在20℃±5℃;相對濕度不大于70%;電源穩定，無磁場、電場干擾。

5、測試前設備要進行預熱

（二）操作步驟

1、在之前的準備工作完成后，接通電源，然后打開主機開關[much]后打開光源開關。

注意：要根據使用說明來啟動計算機。并且要進行預熱。

2、預熱完成夠，按照說明查看是否需要對設備進行校準。

注意：儀器一般是在20天內必須從新進行一次激發校準和發射校準

3、.基本測定

①熒光激發光譜測定

設置儀器參數，掃描發射波長，找到max λ ex、max λ em，以此為發射波長，記錄發射強度作為激發波長的函數，便得到激發光譜。

②熒光發射光譜測定

設置儀器參數，掃描激發波長，找到max λ ex、max λ em，以此為激發波長，記錄發射強度與發射波長間的函數關系，便得到熒光發射光譜。

③差譜測定

設置儀器參數，選擇合適的工作方式，測定背景溶液的發射光譜并儲存起來，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發射波長，得到當時的光度值和儲存的背景值之間的差示值，即差譜。

④峰面積積分

選擇適當的工作方式，對樣品溶液進行積分操作，即得到峰面積積分。

⑤熒光強度

選擇合適的測量參數，設置λ ex、λ em，采用定點讀數或掃描方式，即可測得所選波長處的熒光強度。

⑥定量測定

配制一系列已知濃度的標準溶液，在一定的測定條件下，設置λ ex、λ em，按照由稀至濃的次序，測定標準溶液的熒光強度，繪制熒光強度濃度的工作曲線，不改變儀器參數測定未知溶液的熒光強度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。

4、分析結果

①熒光激發光譜、發射光譜以及其他光譜由儀器控制電腦直接繪出。

②峰面積積分、熒光強度由儀器控制電腦計算顯示。

③定量測試：在相同的測定條件下，測定一系列已知濃度的標準溶液的熒光強度，繪制出熒光強度-濃度的工作曲線。濃度未知的溶液的熒光強度測定后，由工作曲線求出該溶液的濃度。

四、熒光粉光光度計使用注意事項

（一）日常注意事項

1、開機時，請先開氙燈電源，再開主機電源。注意開機順序。

2、每次開機后請先確認兩邊排熱風扇是否工作正常如發現風扇有故障，應停機檢查。

3、主機工作時頂部排熱器溫度很高，切勿觸摸以免受傷。

4、請盡量減少不必要的氙燈觸發次數，避免氙燈在高壓下反復觸發。關閉氙燈電源后，若要重新使用，請等待60秒以后重新觸發。

5、運行未知濃度的樣品測試時，靈敏度設置請從低位向高圍( 0-7)逐步設置。

6、當操作者錯誤操作或其他干擾引起微機錯誤時，應該立即關斷主機電源重新啟動，但無須關斷氙燈電源。

7、單色器內用螺絲緊固處不得松動。

（二）其他注意事項

1、所需溶液要是已經配置好要查看在低溫冰箱里的存放的時間是否超過一星期，如果已超過則需從新配置。

2、實驗所用的樣品池是四面透光的石英池，拿取的時候用手指掐住池體的上角部，不能接觸到四個面，清洗樣品池后應用擦鏡紙對其四個面進行輕輕擦拭。

3、在測試樣品時，注意熒光強度范圍的設定不要太高，以免測得的熒光強度超過儀器的測定上限。

4、實驗結束后及時的清理臺面，處理廢液，清洗和放置好樣品池，將下次要用的溶液放回冰箱。

5、清潔儀器外表時請勿使用乙醇乙醚等有機溶劑，請勿在工作中清潔。不使用時請加防塵罩要保持比色皿的清潔。

五、熒光分光光度計選購指南

1、首先要考慮品牌以及代理商信譽以及售后服務，不僅關系到儀器的質量穩定性，還關系到以后的維修服務。

2、然后要關注儀器的狹縫(光譜帶寬)，狹縫還決定了儀器的分辨率，良好的分辨率可以分辨間隔很小的波峰。

3、儀器的信噪比是一項非常重要的參數，它一定程度上反映儀器的檢出能力。

4、波長[accuracy]度和重復性也是一項比較重要的指標。

5、掃描速度雖然也很重要，但這和需求有關系，如果對時間沒有太多的要求，可以不必在意。

6、綜合以上進行對比選購性價比較為高的。

六、熒光分光光度計與其他分光光度計不同點

相同點：比色皿、檢測器、記錄儀這些基本一樣

不同點：光源，是否需要色劑

紫外、可見分光光度計在紫外區使用氫燈或氘燈，在可見光區使用氘燈或溴鎢燈。它們發出的都是連續光譜，通過三棱鏡（中檔）、光柵（高檔）、濾光片（低級）等分光，這樣兩種燈組合基本涵蓋了紫外-可見光的波長范圍。

熒光分光光度計由氙弧燈發出的光通過切光器使其變成斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上。

紫外-可見分光光度計可用于大部分有色物質的定量監測，通常需要使用各種各樣的顯色劑。熒光分光光度計可用于測試發光材料的發射光譜＼激發光譜＼時間掃描，不需要顯色劑。